PENYEDIAAN SISIP MIKROSKOP
Teknik Menyediakan Sisip Mikroskop
Teknik menyediakan mikroskop iaitu suatu bidang yang luas. Tujuan bahan ini bukanlah untuk menghuraikan secara meluas dan mendalam tentang bidang ini,tetapi hanya memperkenalkan prisip-prisip asas serta beberapa teknik biasa yang boleh digunakan oleh guru-guru sains di sekolah.
Penyediaan sisip kaca mikroskop biasanya melibatkan langkah-langkah yang berikut :
i) Penetapan/pengikatan
ii) Membuat keratan
iii) Perwarnaan
iv) Pendehidratan
v) Mencuci
vi) Lekapan
Kesemua enam langkah tersebut diperlukan untuk penyediaan sisisp kekal, tetapi bagi peyediaan sisip sementara langkah (i), (iv), dan (v) boleh di tinggalkan. Sisip-sisip kekal, jika disediakan dengan baik boleh disimpan selama beberapa tahun. Sebaliknya sisip sementara hanya boleh digunakan sekejap sahaja, kadang kala kurang daripada setenjah jam.Walaubaimanapun sisip sementara lebih kerang disediakan oleh guru-guru biologidi sekolah kerana lebih menjimatkan banyak masa dan kerja, berbanding dengan sisip kekal.
(i) Penetapan/pengikatan
Bahan-bahan biologi yang hendak digunakan untuk menyediakan sisip mesti direndam dalam sejenis cecair atau larutan untuk menyelakkan tindakan bakteria atau kulat. Cecair atau larutan itu dinamakan agen penetap/pengikat manakala proses ini dipanggil penetapan/pengikatan.
Agen pengikat/penetap yang biasa sekali digunakan untuk tisu-tisu tumbuhan ialah ‘ Formalasetik-alkohol’ (FAA). FAA dsediakan dengan mencampurkan lebih kurang 5 cm3 asid asetik glasial 90 cm3 etanol 70% dan 5 cm3 formaldehid 40%.
Tisu-tisu haiwan boleh direndam dalam fomalin neutral. Formalin neutral disediakan dengan mencampurkan sedikit larutan dinatrium tetraborat (boraks) kepada fofmaldehid 40% sehingga menjadi neutral kepada kertas litmus.
Untuk maklumat lanjut tentang jenis-jenis agen penetap/pengikat sila rujuk kepada buku-buku lain.
(ii) Membuat keratan tisu
Tisu-tisu biologi yang hendak diperiksa dengan mikroskop mesti wujud dalm bentuk keratan nipis yang boleh ditembusi cahaya. Keratan tisu tumbuh-tumbuhan lebih mudah disediakan kerana ia lebih keras daripada tisu haiwan.Untuk membuat keratan, tisu tumbuhan biasanya diapit dengan kepingan polistirene sebelum dipotong .
Tisu haiwan yang hendak dikerat mestilah terlebih dahulu direndamkan dalam parafin untuk menjadikannya keras.Langkah-langkahnya adalah seperti berikut:
1. Panaskan sedikit pepejal parafin ( suhu lebur lebih kurang 52-56 celsius ) pada suhu 2 atau 3 darjah lebih tinggi daripada suhu leburnya,dengan kukus air.Masukkan tisu haiwan yang tersebut ke dalam cecair parafin dan biarkan selama satu jam pada suhu yang sama.
2. Ambil sebuah kotak mancis dan sapukan bahagian dalamnya dengan sedikit gliserol.Tuangkan parafin panas (suhu tidak melebihi 58 darjah celcius ) ke dalam kotak mancis tersebut. Letakkan tisu haiwan di bahagian tengah cecair parafin.
3. Pegang kotak mancis itu di atas sebaldi air sejuk dan tiupkan permukaan parafin lebur itu dengan angin,Apabila cecair parafin di permukaan membeku, rendamkan seluruh kotak mancis tersebut ke dalam baldi berisi air sejuk itu. Kesemua parafin dalam kotak mancis akan membeku. Sekarang tisu haiwan itu sedia untuk dipotong menjadi kepingan nipis.
Kadangkala tisu-tisu biologi lebih mudah dipotong dengan menggunakan sejenis mikroton tangan. Harga mikrotom tangan ini adalah agak murah dan mampu dibeli oleh semua sekolah. Tisu yang hendak dipotong itu dimasukkan ke bahagian tentah mikrotom. Pusingkan skru di bahagian bawah mikrotom itu satu pusingan kemudian hiriskan tisu yang menonjol ke atas dengan mata pisau cukur.
(iii) Pewarnaan
Pewarna untuk sisip mikroskop boleh dibahagikan kepada dua golongan utama; i) pewarna bersifat bes, misalnya metilena biru fuksin bes, hablur ungu, safranin dan sebagainya ii) Pewarna bersifat asid , misalnya fast green, hijau muda, anilina biru dan sebagainya.
Pemilihan pewarna untuk tisu dibuat berdasarkan sifatnya, iaitu bersifat bes dan asid. Pewarna bersifat bes digunakan untuk mewarnakan bahagian-bahagian tisu bersifat asid, manakala pewarna bersifat asid pula digunakan untuk mewarnakan bahagian-bahagian tisu bersifat bes. Misalnya. Oleh kerana nukleus sel mempunyai asid nukleik, ia bersifat
asid maka nukleus biasanya diwarnakan dengan pewarna-pewarna bes seperti metilena biru atau safranin.
Selain daripada itu, terdapat juga pewarna-pewarna tertentu yang hanya boleh dilekatkan kepada tisu jika sesuatu mordan digunakan bersama. Sebagai contoh, Ferum (III) Ammonium Sulfat ialah sejenis mordan bagi pewarna hematoksilin dalam pewarna tisu haiwan.
(iv) Banyak jenis cecair organik digunakan dalam proses penyediaan sisip mikroskop. Bahan-bahan organik ini, jika dicampurkan dengan air, akan menghasilkan seuatu koloid yang menganggu penglihatan. Oleh itu, sebelum atau selepas proses pewarnaan (Mengikut keadaan) tisu itu biasanya direndam dalam etanol untuk membuangkan kandungan aairnya. Proses pembuangan air ini dinamakan pendehidratan.
Akan tetapi , jika keratan tisu direndam terus ke dalam etanol tulen, terlalu banyak aair diserap keluar, maka sel-sel itu akan berubah bentuknya atau menjadi rosak. Untuk mengelakkan kesan ini, keratan tisu biasanya direndamkan dalam etanol mengikut giliran yang berikut:
1. Rendamkan dalam etanol 30% selama 1 minit.
2. Pindahkan ke etanol 50% selama 1 minit;
3. Pindahkan ke etanol 70% selama 1 minit;
4. Pindahkan ke etanol 90% selama 2 minit;
5. Pindahkan ke etanol 95% selama 2 minit.
6. Pindahkan ke etanol 100% selama 2 minit.
7. Pindahkan ke etanol 100% yang baru selama 2 minit lagi.
Sekiranya sebelum pendehidratan keratan tisu itu telah direndam dalam sejenis pewarna yang menggunakan etanol 70% sebagai pelarutnya, maka dalam proses pendehidratan yang berikutnya keratan tisu itu TIDAK perlu direndamkan ke dalam etanol 30% , 50% dan 70% lagi ianya boleh terus dimasukkan ke dalam etanol 90%, dan selanjutnya ke dalam etanol 95%, 100%, seperti susunan tersebut di atas.
(V) Mencuci.
Jika lekapan hendak dibuat dengan menggunakan balsam kanada maka selepas pendehidratan, etanol dalam keratan tisuitu mesti dikeluarkan. Ini adalah kerana etanol tidak boleh bercampur dengan balsam kanada. Proses pembuangan etanol dari keratan tisu ini dinamakan mencuci. Akan tetapi, jika gliserol dan bukan balsam kanada yang akan digunakan dalam lekapan, proses mencuci boleh ditinggalkan kerana etanol boleh bercampur dengan gliserol.
Untuk mengeluarkan etanol, keratan tisu biasanya dirandamkan dalam cecair xilem (awas:beracun) selama beberapa ketika. Tetapi xilem mempunyai satu kelemahan sebagai agen pencuci: ia membentuk cecair keruh jika terkena air (biasanya akibat dari mencuci yang kurang sempurna). Minyak cengkih dan minyak kayu cedar juga boleh digunakan sebagai agen pencuci. Jika minyak cengkih dan minyak kayu cedar digunakan, keratan tisu itu mesti direndamkan dalam xilem pula sebelum lekapan dengan balsam kanada.
Vi) Lekapan
Selepas mencuci ,keratan tisu itu boleh diletakkan di atas kepingan kaca kemudian dititiskan dengan sedikit agen pelekap dan ditutup dengan sisip kaca nipis. Peranan agen pelekap ialah menyesar keluar semua udara dari keratan tisu serta memberikanya suatu angka rujuk biasa (refractive index) yang hampir dengan kaca ,iaitu lebih kurang 1.53.
agen pelekap yang biasa sekali digunakan dalam makmal sekolah ialah balsam kanada (yang dilarutkan dalam xilem), biasanya untuk sisip kekal. Akan tetapi, unutk sisip sementara , agen pelekap yang lebih sesuai ialah gliserol.
Sisip kekal yang siap disediakan mesti dilabelkan dengan butir-butir berikut:
i) Nama spesimen dan jenis keratan
( melintang, membujur, dan sebagainya.)
ii) Pewarna yang digunakan
ii) Tarikh disediakan
iv) Nama orang yang menyediakannya.
Teknik-teknik Mewarnakan Spesimen Biologi
Teknik Pewarnaan Keratan Tisu Tumbuhan
1. Safranin dan Fast Green
Keratan tisu daun, batang dan akar tumbuh-tumbuhan hijau seperti pokok keembung, bunga matahari dan sebagainya boleh diwarnakan dengan cara ini. Bahagian nukleus,lignin dan kutikel akan menjadi merah, manakala lain-lain bahagian menjadi hijau atau biru.
Larutkan 1 gram safranin dalam etanol 50% menjadi 100 cm3 . Rendamkan keratan tisu dalamnya selama 1/2 jam atau lebih. Keluarkanya dan basuh dengan air suling. Lepas itu rendamkan dalam campuran asetik-etanol untuk menanggalkan sebahagian daripada safranin itu. Jangan rendamkan spesimen terlalu lama kerana ia menyebabkan semua safranin mungkin tanggal/ Campuran asetik-etanol disediakan dari 1 nm3 asid asetik glasial dan 99 c,3 etanol 70%.
Dehidratkan dalam etanol 90% dan 100%. Rendamkan dalam Fast green selama 1/2 minit atau lebih. Larutan Fast Green disediakan daripada 0.5 gram pepejal Fast green, 50cm3, etanol 100% dan 50 cm3 minyak cengkih. Untuk menanggalkan sebahagian fast green rendam dalam campuran minyak cngkih , etanol 100% dan xilen (nisbah 2:1:1) selama 5 minit. Pindah ke xilen selama beberapa minit. Letak di atas kepingan kaca dan lekapkan dengan balsam kanada atau gliserol.
2. Hematoksilin dan safranin
Nukleus dan kloroplas menjadi ungu, lignin menjadi merah,sitoplasma menjadi ungu muda.
Sediakan larutan hematoksilin seperti berikut: Campurkan 4 g hematoksilin , 25 cm3 etanol 100% dan 400 cm3 larutan tepu ferum (III) ammonium sulfat. Biarkan terdedah kepada cahaya selama empat hari dalam sebuah kelalang yang mulutnya tersumbat dengankapas.Turas.Tambahkan 100 cm3 gliserol dan 100 cm 3 metanol. Biarkan di tempat cerah selama enam minggu.
Rendamkankeratan tisu dalam larutan hematoksilin selama 3 minit. Basuhkan dengan air. Tanggalkan sebahagian pewarna dengan asetik-etanol sambil memerhatikannya di bawah mikroskop (kurang daripada 1 minit). Basuhkan dengan etanol 70%. Rendam dalam etanol 70%. Rendam dalam etanol 70% yang telah ditambahkan beberapa titik ammonium hidroksida. Rendam dalam larutan safranin selama 5 minit Rendam dalam etanol 50% untuk menanggalkan sebahagian daripada safranin. Bagi sisip sementara ,pindahkan keratan tisu ke air suling kemudian lekapkan dalam gliserol. Bagi sisip kekal, dehidratkan dengan etanol 70%,90%,95% dan akhirnya 100%. Rendam dalam minyak cengkih untuk membuangkan etanol. Lekapkan dengan balsam kanan.
Teknik Pewarnaan Keratan Tisu Haiwan
1. Ferum Hematoksilin
Larutkan 3 g ferum (III) ammonium sulfat dalam 100 cm3 air suling. Rendamkan keratan tisu dalam larutan tersebut selama 1/2 jam lebih. Basuh dengan air suling.
Sediakan larutan hematoksilin dengan 0.5 g hematoksilin, 10 cm3 etanol 100%, dan 90 cm3 air suling. Biarkan beberapa hari.
Rendamkan keratan tisu dalam larutan hematoksilin salama 1/2 jam atau lebih. Pindahkan ke larutan ferum (III) ammonium sulfat untuk menanggalkan sebahgian hematoksilin. Basuhkan dengan air paip selama beberapa jam.
Rendam dalam etanol 30%,50%,70%,90%,95%,100%. Pindah ke xilen untuk menanggalkan etanol. Lekapkan dalam balsam kanada.
2. Pewarna Mallory Tiga Peringkat
Mula-mula sediakan tiga jenis larutan yang berikut:
a) 0.1 g asid fuksin dalam 99 cm3 air suling
b) 0.1 g asid fosfomolobdik dalam 99 cm3 air suling
c) 0.5 g anilina biru, 2 g oren G dan 2 g asid oksalik dalam 99 cm air suling.
Rendamkan keratan tisu dalam larutan (A) selama 3 minit. Basuhkan dengan air suling.Basuhkan dengan larutan (B) selama 1 minit supaya warna merah tadi kekal. Basuh lagi dengan air suling. Sekarang rendamkan dalam larutan (c) selama 5 minit supaya ia menjadi biru. Basuhkan dengan air suling. Dehidratkan dengan etanol 30%,50%,70%,90%,95%,100%. Basuhkan dengan xilen untuk menanggalkan etanol Lekap dengan DPX.
Teknik Mewarnakan Tisu yang Mengandungi Lemak (Sudan IV)
Rendamkan keratan tisu dalam formaldehid 40% selama 1 minit. Basuhkan dengan etanol 50%. Rendamkan dalam larutan Sudan IV selama 2 hingga 3 minit. Larutan Sudan IV disediakan dengan melarutkan 5 gram pepejal Sudan IV dalam 100 cm3 etanol 70%.
Basuhkan dengan etanol 50%. Lekapkan dalam gliserol. Bintilan-bintilan lemak akan diwarnakan menjadi merah.
Teknik Mewarnakan Tisu Kulat (Lactophenol-cotton blue)
Tisu kulat seperti Mucor dan Rhizopus boleh diwarnakan dengan Lactophenol-cotton blue . Lactophenol-cotton blue disediakan daripada bahan-bahan berikut:
hablur fenol 20 g
asid laktik 20 g
gliserol 40 g
cotton blue
(metil blue) 0.05 g
air suling 20 cm
Rendamkan tisu kulat dalam Lactophel-cotton blue selama beberapa minit. Basuhkan dengan air untuk menanggalkan pewarna yang berlebihan . Periksa dengan mikroskop.
Teknik Mewarnakan Sel-Sel Darah (Pewarna Leishman)
Mula-mula sediakan lapisan nipis darah seperti berikut: Titiskan setitik darah di satu hujung sisip yang bersih. Dengan segera letakkan sekeping lagi sisip bersendeng 45o kepada sisip pertama, seperti dalam Rajah (46), dan TOLOK KE DEPAN. Suatu lapisan darah yang nipis akan terbentuk.
Keringkan lapisan darah ini SEGERA dengan angin atau dengan mengeraK-GERAKKAN DALAM UDARA, jika dikeringkan dengan perlahan, sel-sel darah akan berubah bentuknya.
Sediakan pewarna Leishman dengan langkah-langkah berikut:
i) Pastikan semua radas yang digunakan adalah bersih dan kering betul.
Ii) Hancurkan 0.2 gram serbuk pewarna Leishman dalam beberapa cm3 metanol 100% dalam sebuah lesung. Tambahkan metanol sedikit demi sedikit sehingga menjadi 100cm3. Teruskan proses menghancurkannya selama 20 hingga 30 minit , supaya pewarna itu betul-betull larut dalam metanol.
iii) turaskan . simpan dalam botol yang tertutup rapi pada 37% C.
Sediakan fosfat tampan pH 6.8 dengan keadah berikut:
i) Larutkan 9.1 gram kaliam dihidrogen fosfat menjadi 1 dm3.
ii) larutkan 9.5 gram dinatrium hidrogen fosfat menjadi 1 dm3.
iii) campurkan 50.8 cm3 larutan (i) dengan 49.2 cm3 larutan (ii).
Rendamkan lapisan darah tersebut dengan pewarna Leishman selama satu hingga satu setengah minit. Tambahkan sama banyak fosfat tampan pH 6.8. Tiupkan dengan mulut supaya pewarna bergaul dengan larutan tampan. Biarkan 10 minit.
Basuh dengan aliran air yang perlahan. Rendam dalam larutan tampan selama 30 saat atau lebih, mengikut keadaan. Keluarkan sisip dan biarkan kering dalam udara.
Periksa dengan mikroskop. Nukleus sel darah putih akan diwarnakan menjadi biru.
Teknik Mewarna Bakteria (Pewarna Gram)
Mula-mula sediakan larutan-larutan yang berikut:
i), Larutan hablur Ungu (atau metil ungu)
hablur ungu - 2.5 gram.
Air suling - 500 cm3
ii). Larutan Iodin
iodin - 5.0 gram
Kalium iodida - 10.5 gram
air suling - 500 cm3
iii) Larutan Safranin (atau neutral red)
Safranin - 5.0 gram
air suling - 500 cm3
atau
Neutral red - 0.5 gram
asid asetik 1% - 1.0 cm3
air suling - 500 cm3
Sapukan bakteria di permukaan sisip supaya membentuk satu lapisan nipis.
Panaskan dengan api selama 2-3 saat supaya bakteria terlekat pada permukaan sisip. Biarkan sejuk.
Rendamkan bakteria dengan larutan hablur ungu atau metil ungu selama 1/2 - 1 minit. Jangan basuh dengan air selepas ini.
Tambahkan larutan iodin dan biarkan 1/2 - 1 minit. Sekarang basuhkan nya dengan sedikit aseton . jangan basuh terlalu lama.
Basuh pula dengan air. Rendam dalam safranin atau neutral red selama 2 minit atau kurang. Basuh sekali lagi untuk membuang safranin yang berrlebihan dengan air. Biarkan kering dalam udara. Periksa Bakteria Gram (+) akan menjadi biru-ungu, manakala bakteria Gram (-) akan menjadi merah.
Teknik Mewarna Kromosom (Kaedah aseton orscein)
Tisu yang sedang mengalami proses mitosis atau meiosis. Seperti hujung akar bawang atau buah zakar belalang (Valanga), boleh diwarnakan dengan kaedah ini.
Mula-mula sediakan larutan aseto-arsein seperti berikut: tambahkan 2 gram orcein kepada campuran 45 cm3 asid asetik glasial dan 55 cm3 air suling. Masukkannya ke dalam sebuah kelalang 250 cm3 dan pasangkan pemeluap Liebeg dalam keadaan tegak. Didihkan selama 30 minit. Biarkan sejuk. Turaskan , hasil turasannya berwarna ungu tua. Simpan dalam peti sejuk.
Jika hujung akar bawang digunakan ia mesti direndamkan dalam asetik-alkohol selama 24 jam terlebih dahulu, kemudian dipindahkan ke dalam asid hidroklorik 1 molar pada 60 C selama 5 minit.
Letakkan tisu itu di atas sisip kaca. Tambahkan beberapa titik aseto-arsein dan koyakkannya menjadi hancur dengan dua batang jarum. Tutupkan dengan penutup kaca nipis . Panaskan sisip kaca dengan api atau plat panas selama 5 minit, tetapi jangan biarkannya mendidih, tambahkan aseto-orsein lagi jika ia tersejat.
Sekarang tutupkan sisip itu dengan beberapa lapisan kertas tisu dan tekankannya DARI ATAS dengan ibu jari ( Jangan biarkannya gelansar ke TEPI) supaya sel-sel akar terpisah antara satu sama lain. JANGAN TEKAN TERLALU KUAT. Ascto-orsein yang berlebihan akan diserap oleh kertas tisu.
Hangatkan sisip di atas plat selama 10 saat lagi, supaya warna aseto-orsein menjadi lebih merah. Periksa dengan mikroskop. Semua kromosom akan menjadi warna merah.
